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荧光分光光度计及其应用
点击次数:50 发布时间:2018-10-23

评述了近年来荧光分光光度计的发展, 介绍了国内荧光分光光度计的研制及生产情 况, 综述了荧光分析技术的应用。

近来 , 我国在荧光分光光度分析技术 领域的研究取得了许多新的进展。如荧光总 发光光谱技术 、荧光探针、光纤荧光传感器、 激光诱导时间分辨发光技术 、荧光薄层扫描 技术 、动力学荧光法等。因此 ,对荧光分光光 度计的要求不断提高 。目前国内生产荧光分 光光度计的厂家较少, 国外厂商提供的都是 中高档的荧光分光光度计 。研制和生产性能 可靠的国产荧光分光光度计具有重要意义。 1 基本原理 当激发光照射某些物质时 ,处在基态的 分子吸收激发光后跃迁为激发态 ,这些激发 态分子在因转动 、振动等损失一部分激发能 量后 ,以无辐射跃迁下降到低振动能级 ,再从 低振动能级下降到基态, 在此过程中激发态 分子将以光的形式释放出它们所吸收的能 量,这种光称之为荧光,所得到的光谱称为荧 光光谱。荧光光谱能够反映荧光物质的特 性。荧光分光光度计是基于物质的这种性质 而对其进行定性及定量分析的一种分析仪 器。 荧光定量分析的数学处理比分子吸收光 谱复杂。一般来讲, 荧光强度 If 等于分子所 吸收辐射的光强度 I a与量子效率 的积[ 1] ,即 If = f·I a = f I0(1 -10 -εbc)。如果荧光 物质的浓度足够低 ,则 If =2 .3 f I 0εbc =kc 。 这就是荧光定量分析的理论公式, 式中 ε、 b 、c 分别是摩尔吸光系数 、液池厚度及被测 物质的浓度。 2 荧光分光光度计的基本结构 荧光辐射是从样品发生的 ,其在所有方 向发射都相同 ,原则上可以从任何角度进行 观测 。但从仪器设计和应用的观点来看, 90° 角度是最方便且是目前使用较为广泛的方 式。 荧光分光光度计的基本结构是 : 光源 ※单色器或滤光片※样品池※单色器或 滤光片※检测器。 目前荧光分光光度计的常用光源为氙 灯,单色器多用光栅 ,检测器主要用光电倍增 管,普通荧光分光光度计的激发和发射波长 一般在 200 ~ 900 nm 。

3 荧光分光光度计的分类 3.1 滤光片式荧光计 3.1.1 单光束滤光片荧光计 单光束滤光片荧光计的工作原理是第 1 滤光片允许紫外线(激发光)通过, 第 2 滤光片可以透射荧光辐射, 但它吸收了任何能向 光电池散射的光 ,对于这类仪器来讲,光电管 及灯的稳定性要求比较高, 否则会引起较大 测量误差 。 3.1.2 双光束滤光片荧光计 贝克曼比例荧光计属于此种类型仪器, 它是采用一种特殊设计的汞蒸气灯, 具有斩 光器作用,使样品和标准各接收 60 Hz 的相 同辐射脉冲并为短的暗间隔所分开, 从而保 持一个恒定的参比水平。这类仪器消除了由 于线路电压波动所引起的变化 ,具有较高的 稳定性。 3.2 荧光分光光度计 3.2.1 单光束荧光分光光度计 在荧光光谱定量分析中 ,滤光片式荧光 计由于有较高的辐射照到样品上而具有较高 的灵敏度, 但因它易引起光谱干扰而逐渐被 荧光分光光度计所取代。 最早, 单光束荧光分光光度计作为紫外 可见分光光度计的一个附件仪器 ,从光源到 探测器只有一束测量光。在测量时, 参比和 样品交替进行, 因而较易引起测量误差 。 3.2.2 双单色器单光束荧光分光光度计 这类荧光分光光度计是 90°角照射样 品,结合两个光栅单色器的单光束仪器。它 是由氙灯发出激发光, 经过激发单色器分出 的单色光照射到样品上, 然后使发射单色器 接收荧光到检测器。 3.2.3 双单色器双光束荧光分光光度计 这类仪器将从光源来的辐射在穿过第一 个单色器照射到液池之前分成两路, 这可用 斩波器或光束分离器来完成。分光后一部分 辐射通过液池及第二个单色器照在检测器 上,而另一束辐射从液池及第二单色器的侧 旁经过照在检测器上。如果以斩波器来分 光,则可使用一个单独检测器轮流测定来自 两光束的辐射;如果使用光束分离器,则需要 第二个检测器来测量参比光束的强度。在这两种情况下 , 荧光光谱都由测得的来自样品 的发射强度与作为波长函数的参比光束强度 的比值组成 。 FRS_100 型荧光分光光度计分别属于上述两 种情况。 还有一类双光束荧光分光光度计是将从 光源辐射的光分为两束, 一束通过液池而另 一束用作参比 。第二束往往要通过一个参比 溶液或在测定前作强度衰减 , 在许多仪器中 采用了零点测定法, 即利用衰减器将参比光 束在检测器上的响应值调节到与样品的发射 在检测器上的响应值相同, 然后读得衰减器 上此时所调定的值, 可利用同一检测器交替 测量这两光束 ,或以不同的检测器同时测定 。 第三类双光束荧光分光光度计是以美国 Turner 公司生产的 210 型荧光分光光度计 为代表。它具有激发光光源和参比灯的两道 光束 ,交替地照射于测量辐射器上 ,参比灯在 固定波长的强度是可变的, 由光平衡系统调 节参比灯的能量使其与激发光的能量相同 , 从参比灯发出的另外一束光通过衰减器到达 光电倍增管检测器 。衰减器是由一个与发射 单色器联结的传动轮所驱动 , 这使得光电倍 增管的光谱感应与发射单色器的光谱特性的 组合得到补偿 ,因此交替照射于光电倍增管 上的是一束经过校正的能量恒定的光束和一 束由试样发射的荧光, 在整个扫描的波长范 围内记录两道光束在每一波长的比率所得到 的曲线就是绝对荧光光谱 。 3.2.4 激发和发射均为双单色器的荧光仪 Spex 公司的 Fluorolog_2 系列仪器的激 发和发射均为双单色器, 这种仪器减少了杂 散光的干扰 , 对于生物样品等光散射比较强 的样品测定十分有利。这类仪器灵敏度非常 高,稳定性十分好。

4 荧光分光光度计的发展 由于荧光分光光度计灵敏度高 、特异性 强,因此应用范围较为广泛 。但由于它对样 品有一定要求 ,所以目前还不属于实验室的 常规仪器 ,一般用于科研工作 ,目前使用的荧 光分光光度计以国外中高档仪器为主。 4.1 国外荧光分光光度计 目前进入中国市场的外国厂商主要有日 立公司 、岛津公司以及美国的 PE 公司等。 这些公司的仪器性能指标如表 1 所示。 表 1 国外荧光分光光度计性能指标比较 参数项 日立F_4500 PE LS_50B 岛津 RF_5301PC 光源 150 W 氙灯 8 .3W/ 50Hz 氙灯 8 .9W/ 60Hz 氙灯 150W 氙灯 扫描范围 λex 、λem 200 ~ 900 nm λe x 200 ~ 800 nm λem 200 ~ 900 nm λex 、λem 220~ 900 nm 分辨率 1.0 nm 2.5 nm 1 .5 nm 波长精度 ±2 nm ±1 .0 nm ±1.5 nm 最少取样量 0 .6 mL 2 mL 2 mL 从表 1 可以看到使用脉冲作为光源是 PE 公司 LS_50B 的特点 , 该光源的使用可降 低氙灯的功率, 节约能源 ,延长使用寿命 。而 波长扫描速度的改观在日立公司仪器中具有 明显的优势。另外日立公司推出的 F_4500 型荧光分光光度计采用水平光束测量, 样品 量只需 0 .6 mL ,这对痕量分析大有益处 。虽 然荧光分光光度计近年来在光学系统和检测 系统方面没有明显改观, 但是随着计算机软 件的飞速发展 ,荧光分光光度计的应用软件 系统不断完善 ,各大公司均提供了许多用户 欢迎的应用软件 ,使仪器的操作及数据处理 自动化程度提高 。 4.2 国内荧光分光光度计的应用与研制 70 年代末期以来, 国内高等院校及科研 单位逐渐引进了中高档荧光分光光度计 。笔 者统计了 1996 年《分析化学》杂志刊载荧光分析方面的文章表明, 国外仪器使用率高达 85 %以上 。常用的仪器型号为日立 540 、日 立 RF_3010 、岛津 RF_5000 ,的荧光分光光度计在国内市场中占有绝对优 势。 中国科学院系统研究单位在 70 年代引 进国外荧光仪器 3 台, 80 年代引进 13 台 , 1990 ~ 1995 年引进 6 台。由此情况可见国 内引进仪器形势 。国外高档仪器的引进, 对 我国荧光分析技术的发展起到明显的推动作 用。 国内荧光分光光度计的研制起步较晚 , 多为自行装配 ,而商品化的仪器不多,已形成 商品化的仪器有 :天津光学仪器厂生产的 WFD 系列产品 , 厦门分 析仪器厂生产的 GFY 系列以及与厦门大学合作研制的 YF 型系列产品。另外上海第三分析仪器厂先后 生产几种型号荧光分光光度计 ,如 970MC 型 荧光分光光度计 ,目前国内厦门大学化学系 对荧光仪的研制和开发做了大量工作 ;国内 有一些单位研究激光荧光光谱仪 ,如核工业 部化工冶金研究所研制的时间分辨激光荧光 光谱仪,灵敏度比普通荧光光度计高十几倍 ;时间分辨荧光生化(免疫)分析仪, 采用镧系 元素标液生化分析, 其灵敏度、特异性 、稳定 性均可与同位素标液方法相媲美。南开大学 开发一种便携式荧光光谱仪采用光纤采样输 入,CCD 阵列接收 , 笔记本微机数据处理技 术,特别适合于在线和野外工作 。光纤荧光 传感器的应用给荧光分析仪器注入活力, 而 电荷转移检测器的引入大大改善了荧光分析 仪器的性能。 5 荧光分光光度计的应用 5.1 无机分析 荧光分析法由于灵敏度高 、动态线性范 围宽等优点, 在一些领域中应用广泛。在无机元素分析中 ,主要是通过待测元素与有机 试剂(或荧光试剂)生成配合物或发生荧光猝 灭效应来测定元素的含量 。目前可以通过荧 光分析测定 70 多种金属离子和阴离子 , 如 Ag 、Al 、As 、Au 、Be 、Bi 、 Ca 、Cu 、Ge 、Ga 、Hf 、 Hg 、In 、Ir 、Li 、Mg 、M n 、Nb 、Ni 、Os 、Pb 、Pt 、 Ru 、Sb 、Sc 、Si 、Sn 、Sr 、Ta 、Tl 、Th 、Ti 、V 、Y 、 W 、Zn 、Ce 、Dy 、Eu 、Gd 、La 、Lu 、Sm 、Cd 、Cr (Ⅵ )、Se 、Te 、Re 等。 增效试剂在无机物荧光分析中的应用仍 是一个十分活跃的研究领域。稀土元素的荧 光体系、催化动力学荧光分析 、新荧光试剂及 荧光探针试剂的合成均是目前研究的热点, 而将分离手段与荧光光度法相结合, 将有效 地提高分析方法的适应性, 如氢化物与荧光 法、色层法与荧光法相结合,这将是微量技术 与痕量分析相结合提高分析方法的灵敏度、 改善选择性和拓宽荧光分析法应用领域的途径。 5.2 有机物分析 近年来有机物荧光分析研究在我国发展 迅速, 年文献量不断增加 。主要应用领域有 中西药和临床、食品营养和添加剂等试样。 激光诱导荧光法诊断恶性肿瘤 ,显微荧光法 研究药物与细胞的相互作用 ,DNA 编序及含 量的荧光法测定均是目前受到关注的热点问 题。 5.3 荧光分析技术研究 近年来 ,荧光分析技术在我国有了长足 的发展。激光诱导和时间分辨荧光法在提高 分析灵敏度和改善选择性方面具有独到之 处;三维荧光光谱可以同时利用不同发光物 质间荧光波长和荧光寿命的差别 ,增加分析 方法的信息量。林竹光等将 Apple Ⅱ微机与 日立 659_103 荧光光度计联接, 设计了一套 多功能软件,除了可以得到常规荧光光谱、导数荧光光谱以外 ,还可以得到三维荧光光谱 及等高图 。还有人把阿达玛变换多通道成像 技术与荧光显微镜结合起来 , 可以得到阿达 玛变换三维荧光图象。 这些荧光技术的研 究,将对我国荧光分光光度计的研制和开发 起引导作用。 从表 2 统计的 369 篇有关荧光分析应用 文献[ 2] 可见, 我国在荧光分析领域中目前仍 以无机分析为主 ,而荧光分析技术的研究也 占有相当高的比例, 这说明我国分析工作者 对荧光分光光度计的开发、改造以及研制极 为关注,这将大大推动我国荧光分光光度计 的发展。 表 2 荧光分析技术与应用领域论文统计 项 目 无机分析 有机分析 荧光分析技术 文章篇数 162 38 169 占比例(%) 44 10 46 6 荧光分光光度计与其它仪器联用 荧光分析法因具有灵敏度高 ,线性动态 范围宽等优点 ,愈来愈引起人们的重视 ,尤其 是近年来激光 、计算机、电子学等新技术的飞 速发展,加速了荧光分光光度计与其它技术 的结合而形成多种多样的新型荧光分析仪。 荧光分光光度计的联用技术与紫外可见 分光光度计的联用技术有许多相似之处 。首 先它可以作为一种仪器的检测器 ,其次可以 作为一个独立的主体与其它附件相连接, 形 成一种新的测试系统, 最后它还可以与其它 分析技术相结合构成一种新型的分析仪器。 6.1 荧光检测与 HPLC 联用 液相色谱检测器种类很多 ,灵敏度较高 、 选择性较好的荧光检测器在进行微量分析中 经常使用 。如许多芳香族化合物如蒽、菲、芴 等在特定条件下发出特征荧光 , 利用 HPLC的荧光检测 器可以同 时测定上 述物质。 Tanabe 等[ 3] 设计一种供 HPLC 用的多波长 荧光检测系统 ,有 4 个干涉滤光片和光电倍 增管通道 ;Gluckman 等 [ 4] 研制的荧光检测 器,流通池为 150 μL , 可用于毛细管 HPLC 和超临界色谱, 其最小检测量为 0 .2 pg 。 6.2 荧光检测与离子色谱联用 M ho 等人[ 5] 研制一套供离子色谱用的 双光束激光激发间接荧光检测器 ,它用具有 荧光的淋洗离子维持恒定背景信号, 当待测 离子淋出时, 信息观测信号减少。这种荧光 检测器可以检测纳克级阴离子 ,方法灵敏度 非常高。 6.3 光导纤维与荧光分光光度计的联用 光导纤维目前已被广泛应用于许多领 域,章竹君等人已成功地将光导纤维制成荧 光光纤化学传感器。有些厂家已有商品仪器 形成 ,如江苏分析仪器厂生产的 8510 型多功 能光纤光度计。这类仪器由荧光分光光度计 引入两支光纤导管, 一支光纤则将荧光信号 传输到荧光分光光度计中进行测量, 从而形 成了一种高灵敏度 、遥测痕量分析技术。光 纤便携式荧光光谱仪的制成 , 特别适合在线 和野外工作。光纤多频率相调制荧光计以及 液芯光纤荧光计是目前开发的新型光纤荧光 仪。 6.4 激光光源引入荧光分光光度计 激光光源引入荧光计在我国开发较早, 也是目前应用比较成熟的仪器之一, 如测铀 仪就是其中的代表[ 6] 。时间分辨激光荧光 分光光度计的研制成功, 大大改善了荧光仪 器的性能 ,这类仪器已广泛应用于环境监测、 稀土分析 、冶金、化工 以及生 化等 领域

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