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微量分光光度计的校准方式
点击次数:63 发布时间:2018-10-23

引言 微量分光光度计的出现解决了微量样品采用分 光法定性及定量测试的问题。基于此特点,该类仪 器被广泛用于生物、医学等检测样本量稀少并且价 格昂贵的领域。微量分光光度计属于分光光度计类 测试仪器,遵循朗伯比尔定律,但较普通的分光光 度计还是有很大的改进。随着仪器使用量的增多, 不得不考虑该类仪器的溯源性问题。2015 年相关部 门提出并计划编制该类仪器的校准规范,但至今还 未出版正式的国家校准规范。本文针对微量分光光 度计的测试原理和功能特点,分别对两种校准方式 进行了探讨,并提出了建议。


 1 微量分光光度计的测试原理及功能特点 微量分光光度计的独特之处在于它对测试样品量 的要求非常低,现有的仪器中可测量最低为 0.3 μL 的 样品,可以节省非常稀少且昂贵的样品量。检测波 长范围 200 ~ 1 000 nm,多数仪器设定了定点测试 波 长 230 nm、260 nm 和 280 nm, 便 于 DNA、RNA 和蛋白质的测试。采用发光稳定且不需预热的氙灯 代替钨灯和氘灯作为光源,寿命更长,光强更大。 该类仪器中精度稍高的都在使用电感耦合阵列检测 器(CCD),其光谱范围、量子效率、信噪比等指标 都远高于光电二极管阵列。 使用该类仪器多用其基座检测模式,该功能是 实现微量测试的关键技术。即,用微量移液枪吸取 样品滴加在检测基座上,基座上包埋了一根接受光 纤,放下检测臂与液体接触,检测臂上有检测光纤, 应用液体的表面张力在检测基座和检测臂之间自动 形成标准液柱。液柱高度相当于光程,液柱高度可 设定为 0.05 nm、0.1 nm、0.5 nm 等。光源发出的光与普通的分光光度计相比,从点样到测试完成 的时间大大缩短,且省去了清洗比色皿的程序。该 检测基座只需用拭镜纸擦拭即可。该类仪器可以实 现的检测功能如下:普通的紫外 - 可见分光光度计 检测、DNA/RNA 浓度检测、蛋白质浓度检测等。

2 微量分光光度计的校准方法分析 通过查阅资料,现有的微量分光光度计普遍具 有的技术参数,如表 1 所示。 与普通的分光光度计比较,一些基本的技术参数还是比较一致的。但是该类仪器预设了 DNA、 RNA、蛋白质、荧光染料吸光度值与浓度的对应关系, 所以可以直接给出这些样品的浓度值。根据以上技 术参数及测试原理,对微量分光光度计的校准就有 两种思路, 一是从分光光度计的原理参照普通分光 光度计的检定规程 JJG 178-2007《紫外、可见、近 红外分光光度计》来校准,另一种思路是从该类仪 器的测量结果入手,以浓度标准物质来校准其测量 值的示值误差等。下面对两种思路做分析对比,并 给出合理建议。 

2.1 以滤光液标准物质进行校准 该方法可以参照 JJG 178-2007 进行部分项目的 校准。可将波长准确性、波长重复性、吸光度准确 性、杂散光等仪器主要关键的技术指标列为校准项 目。对波长准确性和波长重复性的校准可以使用现 有的氧化钬波长溶液标准物质,该标准溶液在波长 240 ~ 650 nm 范围有 10 个以上尖锐、峰位明确的吸 收峰。吸光度的准确性可以使用 JJG 178-2007 给出 的方法,配制一定浓度的重铬酸钾高氯酸溶液或重 铬酸钾硫酸溶液,用高精度的紫外可见风光光度计 定值其在 235 nm、257 nm、313 nm、350 nm 处的吸 光度值。通常是在光程为 10 mm 定值,使用时可根 据朗伯比尔定律 A = - kLc 来转换更小光程时的吸光 度值,当仪器给出的是标准为光程 10 mm 的吸光值 时则不需要将标准值换算即可进行比较。其次要注 意校准时环境温度与定值时温度的匹配性。杂散光 特性可以根据 JJG 178-2007 的要求使用 10 g/L 的 溶液和 50 g/L 的亚硝酸钠分别在 220 nm 和 340 nm 处检测仪器的透光率或吸光度值。以上校准 方式和项目是基于微量分光光度计的测量原理,结 合生产商给出的技术参数,使用者可以利用校准结 果对被校仪器有一个综合的评价。此外,如果希望进一步了解仪器的基线平直度和基线噪声等指标也 可参照 JJG 178-2007 来制定校准方法。 

2.2 以浓度标准物质进行校准 该方法是在微量分光光度计可以直接测定核酸 和蛋白质类物质的含量值基础上,以 DNA 标准物 质、RNA 标准物质或蛋白质标准物质来测定标准物 质的测量值与标注值之差作为仪器的示值误差来评 价仪器的计量特性。该类仪器预设了定点波长测试 功能,并且预设了吸光度值与浓度值的关系。核酸 和蛋白质的最大吸收波长 260 nm、280 nm,为了判 断核酸或蛋白质的纯度还增加了 A230 nm 用来表示 样品中存在的一些污染物如碳水化合物、苯酚、多 肽等,A320 nm 用来表示样品的浑浊度和其他干扰 因子。用浓度标准物质来校准该类仪器还可以将测 量值的重复性和仪器的线性纳入校准项目,当然仪 器线性的评价需要用到不同浓度的系列标准溶液。 3 结语 综合上述分析,第一种校准方式在稍加细化的 基础上即可以开展校准工作,且对于广大的计量工 作者来讲比较容易上手,标准物质价格较低且容易 获得。而后一种校准方式虽然可以给出微量分光光 度计的测量结果的示值误差、线性等计量特性优劣, 但在实际校准过程中如何选定标准物质,仅单一标 准物质还是核酸类和蛋白质类共同使用,因为两者 是在不同的吸收波长下进行定量测量,考查的是不 同波长下浓度测量的准确性。而且还需要考虑 DNA 或 RNA 标准物质及蛋白纸标准物质的稳定性、经 济性和易获得性,且对存储条件的要求不能太高, 尤其是有些 DNA 含量标准物质的存储温度要求较 低,不便于计量工作人员进行现场校准。所以在 JJG 178-2007 的基础上研制一套系列标准液,对该类仪 器的波长准确性、吸光度准确性、杂散光等计量特 性进行校准,通过校准结果可以客观、全面地评价 仪器的技术指标,给使用者了解该仪器提供更加综 合的数据。

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